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甘油三酯（triglyceride, TG）含量测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
TG是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，不仅是细胞膜的主要成分，也是重要呼吸底物。
测定原理：
用异丙醇抽提取TG，KOH皂化TG后水解生成甘油及脂肪酸，过碘酸氧化甘油生成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色物质，在420nm有特征吸收峰，其颜色的深浅与TG含量成正比。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、可调式移液枪、双蒸水
试剂组成和配置：
试剂一：液体×2 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体×1 瓶，4℃ 避光保存。
试剂五：液体×1 瓶，4℃ 避光保存。
试剂六：液体×1 瓶，4℃ 避光保存。
标准品：液体×1 支，1mg/mL 标准甘油三酯溶液，4℃保存。
TG 的提取：
1、组织中TG的提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即TG待测液。
2、细胞、细菌中TG的提取：先收集400-500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1mL试剂一，超声波破碎 1min（强度 20％，超声 2s，停 1s），8000g，4℃离心 10min，取上清，即TG待测液。
3、血清（浆）样品：直接测定。
测定操作：
1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零。
2．水浴锅预热到 65℃。
空白管 |
标准管 |
测定管 |
|
双蒸水（μl） |
10 |
/ |
/ |
1mg/ml标准液（μl） |
/ |
10 |
/ |
TG待测液（μl） |
/ |
/ |
10 |
试剂一（μl） |
125 |
125 |
125 |
试剂二（μl） |
25 |
25 |
25 |
加试剂一后充分混匀，再加试剂二，剧烈振荡30s，静置，待分层后取上层溶液15μL，置于新的Ep管。
3．甘油三酯含量测定：
空白管 |
标准管 |
测定管 |
|
上层溶液（μl） |
15 |
15 |
15 |
试剂三（μl） |
50 |
50 |
50 |
试剂四（μl） |
15 |
15 |
15 |
充分混匀，65℃水浴3min |
|||
试剂五（μl） |
50 |
50 |
50 |
试剂六（μl） |
50 |
50 |
50 |
充分混匀，65℃水浴15min |
|||
待冷却后，置于微量石英比色皿/96 孔板测定420nm处吸光值，记为A空，A标和A测。
注意：空白管和标准管只需测定一次。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 血清（浆）中甘油三酯含量计算：
TG 含量（mg/dL）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）×100 mL
=100×（A测－A空）÷（A标－A空）
C 标准品：1mg/mL；100mL：血清体积，1dL=100 mL。
2. 组织中甘油三酯含量计算：
(1)按样本蛋白浓度计算
TG 含量（mg/ mg prot）= C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷Cpr
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷ Cpr
(2)按样本质量计算
TG 含量（mg/ g）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷W
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷ W
C 标准品：1mg/mL ；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g/mL
3. 细胞、细菌中甘油三酯含量计算：
TG含量（mg/104cell）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷细菌或细胞（104cell/L）
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷细菌或细胞（104cell/L）
C 标准品：1mg/mL。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
1. 血清（浆）中甘油三酯含量计算：
TG 含量（mg/dL）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）×100 mL
=100×（A测－A空）÷（A标－A空）
C 标准品：1mg/mL；100mL：血清体积，1dL=100 mL。
2. 组织中甘油三酯含量计算：
(1)按样本蛋白浓度计算
TG 含量（mg/mg prot）= C 标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷Cpr
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷ Cpr
(2)按样本质量计算
TG 含量（mg/g）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷W
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷ W
C 标准品：1mg/mL ；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g/mL
3. 细胞、细菌中甘油三酯含量计算：
TG 含量（mg/104cell）=C标准品×（A测－A空）÷（A标－A空）÷细菌或细胞（104cell/L）
=（A测－A空）÷（A标－A空）÷细菌或细胞（104cell/L）
C 标准品：1mg/mL。
注意事项：
1. 试剂盒中有易挥发性物质，实验过程中需佩戴手套和口罩，试剂瓶盖打开后应该及时盖紧。
2. 加试剂二后需剧烈震荡，使待测液中甘油三酯得到充分提取。
3. 最低检出限为 100μmol/L。
