胃蛋白酶（Pepsin）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。

测定原理：

胃蛋白酶可催化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂二充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入15mL蒸馏水充分溶解。

试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体×1 支，0.5μmol/mL 酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。

粗酶液提取：

组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到580nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。

3. 标准管：取0.5 mL EP管，加入20μL标准品，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板，580 nm 测光吸收，记为A 标准管。

4. 空白管：取0.5 mL EP管，加入20μL蒸馏水，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板，580nm测光吸收，记为A标准空白管。

5. 对照管：取0.5mL EP管，加入100μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，盖紧后摇匀1min；加入20μL粗酶液，混匀后 8000g 4℃离心10分钟；取上清液20μL，加入新 EP管，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，580nm测光吸收，记为A空白管。

6. 测定管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，100μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，盖紧后摇匀1min；8000g 4℃离心10分钟；取上清液20μL，加入新EP管，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，580nm测光吸收，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式：

a.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

C 标准品：标准品浓度，0.5μmol/mL 酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10^-2 mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

C 标准品：标准品浓度，0.5μmol/mL 酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10^-2 mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

注意事项

试剂三、试剂四、试剂五临用前配制，配制好用不完的试剂4℃可保存一周。