酸性蛋白酶（Acid protease, ACP）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理：

酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算ACP活性。

自备仪器和样品：

水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、0.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 4mL 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 4mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 20mL 蒸馏水溶解。

试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

2. 血清或培养液：直接测定。

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。

3.对照管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，680nm测定光吸收，记为A对照管。

4.测定管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

5.空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸馏水，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A空白管。

6.标准管：取0.5mL EP管，加入40μL标准品，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A标准管。

ACP 活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

ACP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/g）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）× 稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

（3）按照液体体积计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T=3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

（4）按照细胞数量计算

ACP 活性单位定义：30℃每 10⁴个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/10⁴cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T = 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议

称取同样质量的样品，加入 1mL 蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10 ^-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

ACP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）× 稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=3125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W

 

（3）按照液体体积计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/mL）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T=3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

（4）按照细胞数量计算

ACP 活性单位定义：30℃每10⁴个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/10 4 cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T = 3125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液

蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL 蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10 ^-2 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

注意事项：

临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。