3- 磷酸甘油酸激酶

（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体25mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加10mL蒸馏水充分溶解。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL

提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10 4 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500

万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

3. 液体：直接检测。

测定操作

1. 分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 取1mL石英比色皿，依次加入500μL试剂一，100μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂四，200μL试剂五，100μL粗酶液，充分混匀，记录340nm 处10s的吸光值A1和310s的吸光值 A2，△A=A1-A2

 

 

 

 

计算公式

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（U/10⁴cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

配制好的试剂二、试剂三、试剂四、试剂五3天内使用完。