果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6 二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂四:液体×1 支,4℃保存;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂二瓶中加入17mL试剂一和1.13mL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用;
(2)在试剂三中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置备用;现配现用;
(3)在试剂四中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置待用;现配现用;
(4)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四和170μL试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和10min20s后的吸光值A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意:不同匀浆组织中 PFK活力不一样,做正式试验之前请做1-2只预试,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使 ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
PFK 活力单位的计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=321×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=321×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=321×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.642×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=642×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=642×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=642×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol 果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T
=1.284×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。