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α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。
测定原理
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎，冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH 活性测定。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用；
（2）在试剂六中加入1mL蒸馏水，充分溶解待用；现配现用；
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
α-KGDH 活性计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T
=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.65×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T
=3216×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=650×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
α-KGDH 活性（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.3×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
