线粒体转氢酶-1（TH-1）试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH 位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化 NADH+NADP⁺和NAD⁺ +NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代 NADP⁺，TH-1催化APADP⁺ 还原生成的APADPH在375nm 有特征光吸收，因此通过测定375nm 光吸收增加速率，来计算TH-1 活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 25mL×2 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，

超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-1 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂

三中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 1000μL 工作液，混匀，立即记录 375nm处

初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

TH-1 活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T

=164×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×W) ÷T

=82×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1活性（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×500) ÷T

=0.164×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.1×10^-3 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×10³ L/mol /cm；d：

比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。