组织及血液碱性磷酸酶（AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书

微量法

产品说明：                           

AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品：液体×1支（EP管中），2 μmol/mL酚标准液，4℃保存。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。

2. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

二、测定步骤：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30min以上。

3. 空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 对照管： 取EP管，加入40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀；最后加入4μL上清液，混匀后于510nm测定吸光度，记为A对照管。

6. 测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。

其中标准管和空白管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。

三、AKP/ALP活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 血液中AKP/ALP活力计算

活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚定义为一个活性单位。

AKP/ALP活力(U/mL)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总] ÷V样×V样总÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02 mL； V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V样总：1mL；T：反应时间（min），15 min。

2. 组织中AKP/ALP活性计算

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚。

AKP/ALP(U/mg prot)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T

                  = 6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克样品每分钟催化产生1 μmol酚。

AKP/ALP(U/g )= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(V样÷V样总×W)÷T

                 = 6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.004mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），15 min。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

1． 血液中AKP/ALP活力计算

活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚定义为一个活性单位。

AKP/ALP活力(U/mL)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总] ÷V样×V样总÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02 mL； V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V样总：1mL；T：反应时间（min），15 min。

2. 组织中AKP/ALP活性计算

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          

AKP/ALP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T

                      =6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克样品每分钟催化产生1μmol酚。

AKP/ALP(U/g)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(V样÷V样总×W)÷T

                 =6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.004mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），15 min。

注意事项：

1. 试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。

2. 试剂四变蓝绿色后不能再使用。

3. 加入试剂四后必须立即混匀，否则显色不完全。