谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书

微量法

产品内容： 

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：10mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂三：粉剂×2 瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂四：15mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

    GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。

    GS 在ATP 和Mg²⁺存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品：

    可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本测定的准备

1、 细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、 血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

 

 

 

 

 

 

 

 

2、 在EP 管中加入下列试剂：

试剂名称（μL）	测定管	对照管
试剂一	160
试剂二		160
试剂三	70	70
样本	70	70
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴30min
试剂四	100	100

混匀，静置10min后，8000g，常温离心10min，取200μL上清至微量石英比色皿或96孔板中，测定540nm 处的吸光值A。△A=A测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

GS 活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定计算公式如下：

1. 血清（浆）GS活性

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每min使540下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

计算公式：GS（U/mL）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =19×ΔA

2. 组织、细菌或细胞GS 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（Cpr×V 样）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

GS（U/g 鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

GS（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =0.038×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.4mL；V 样：加入样本体积，0.07mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1、 血清（浆）GS 活性

单位定义：每mL 血清（浆）在每mL 反应体系中每min使540下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。

计算公式：GS（U/mL）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.005÷T =38×ΔA

2、 组织、细菌或细胞GS 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。

GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（Cpr×V 样）÷0.005÷T =38×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。

GS（U/g 鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T =38×ΔA÷W

 

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。

GS（U/10⁴cell）＝ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T =0.076×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.4mL； V 样：加入样本体积，0.07mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。