谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GLS（EC 3.5.1.2） 存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

测定原理：

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：

试剂一×2 瓶，60 mL，4 ℃保存；

试剂二×1 瓶，40 mL，4 ℃保存；

试剂三×1 瓶，60 mL，常温保存；

试剂四×1 瓶，5 mL，常温保存；

试剂五×1 瓶，3 mL，常温保存；

试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。

2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：

试剂名称（uL）	测定管	对照管
样本	25
蒸馏水		25
试剂一	100	100
试剂二	400	400
混匀，37℃水浴 1 小时
试剂三	525	525
混匀，8000 g，25℃离心 10 min；取上清液，在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂
上清液	130	130
试剂四	30	30
试剂五	20	20
试剂六	20	20

混匀，420nm 处读取测定管和对照管吸光值，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做

一管。

酶活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）GLS 活性

单位定义：每mL血清（浆）每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol /h/mL）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷T=363.1×(ΔA -0.1301)

2、组织、细菌或细胞 GLS 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg蛋白质每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h/mg prot）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h/g 鲜重）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(W÷V样总)÷T

=363.1×(ΔA-0.1301)÷W。

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h/10⁴cell）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(500÷V 样总)÷T

=0.7262×(ΔA -0.1301)

V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）GLS 活性

单位定义：每mL血清（浆）每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h/mL）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷T=726.2×(ΔA-0.1301)

2、组织、细菌或细胞 GLS 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg蛋白质每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h /mg prot）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=726.2×(ΔA -0.1301)÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol /h /g 鲜重）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷(W÷V 样总) ÷T

=726.2×(ΔA -0.1301)÷W。

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞每小时催化谷氨酰胺生成1μmol氨定义为一个酶活力单位。

GLS（μmol/h/10⁴cell）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷(500÷V样总)÷T

=1.4524×(ΔA -0.1301)

V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：

样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。