非蛋白巯基测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功能，对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。

测定原理

巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。

自备实验用品

天平、研钵、可见分光光度计、恒温水浴锅、1mL玻璃比色皿和蒸馏水，甲醇。

试剂组成和配制

提取液：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 40 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃避光保存。

样品的制备

1. 动物、植物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后加入4mL甲醇，室温震荡10min，然后 10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）然后10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3. 血清、培养液：取0.1mL，加0.4mL甲醇，室温震荡10min，然后10000g，4℃离心10min，

取上清置冰上待测。

操作步骤

	对照管	测定管
样品（μL）	200	200
试剂一（μL）	750	750
试剂二（μL）		50
H2O（μL）	50
混匀，25℃静置10min，1cm光径玻璃比色皿，双蒸水调零，测定412nm吸光值， ΔA=A测定-A对照。

计算公式

标准曲线：y = 1.7236 x，R² = 0.9994

1. 组织：

非蛋白质巯基含量（μmol/g）=ΔA÷1.7236×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×5

=14.5×ΔA÷W

2. 血清、培养液：

非蛋白质巯基巯基含量（μmol/L）=ΔA÷1.7236×V 反总÷V 样×5×10³ 

=14500×ΔA

3. 细胞：

非蛋白质巯基含量（μmol/10⁴）=ΔA÷1.7236×V 反总÷(V 样÷V样总×细胞数量)×5

=14.5×ΔA÷细胞数量

V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应中样品体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积1mL； W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；10³：1mmol/ L=10³μmol/ L

注意事项

最低检出限为10μmol/L。