超氧阴离子清除能力试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

测定原理

 

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O^2-.)，与盐酸羟胺反应生成 NO₂^－，NO₂^－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与 530nm的吸光值呈负相关。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 300ul×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加 30mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂五：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

样品处理

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL

提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

4. 粉剂药物可配制成相同浓度，比如 1mg/mL。

测定操作

注意：空白管只需测定一次。

 

 

 

 

 

 

	空白管	对照管	测定管
试剂一（μL）	6	6	6
试剂二（μL）		400	400
H2O（μL）	500	100
充分混匀，25℃反应 1min
样品（μL）			100
试剂三（μL）	200	200	200
充分混匀，37℃反应 30min
试剂四（μL）	200	200	200
试剂五（μL）	200	200	200
充分混匀，37℃显色 20min，于1mL玻璃比色皿，以空白管调零，在530nm处测定对照管和测定管的吸光值，分别记为A对照管和A测定管。

计算公式

超氧阴离子清除率 I%=（A对照管-A测定管）÷A对照管×100%

注意事项

1. 试剂一4℃可保存2个月，配制好的试剂二4℃可保存一周，建议实验前配制，并尽快使用。

2. 样品处理完后立即进行测定，或者低温保存不超过24小时。