过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒说明书

微量法

产品内容：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

工作液：24mL×1瓶，4℃保存；

产品简介：

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H₂O₂，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

操作步骤：

一、粗酶液提取：   

1、 细菌、细胞或组织样品的制备   

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1ML提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200W，超声3秒，间隔10秒。重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、 血清（浆）样品：直接检测。

二、操作步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min，调节波长到240nm，蒸馏水调零。

2、 测定前将CAT检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。

3、 加入10μL样本和190μL工作液，混匀5s或者在酶标仪上振动5s并立即计时，记录240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2

三、CAT活性计算（用石英比色皿）：   

1、 血清（浆）CAT活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mL）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA=459×ΔA

2、 组织CAT活力计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mg prot）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=459×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/g mass）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷样本鲜重（g/mL）=459×ΔA÷样本鲜重（g/mL）

3、 细菌或细胞中CAT活力计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每分钟反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/10⁴ cell）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷细胞密度（10⁴ cell /mL）=0.917×ΔA

CAT活性计算（用96孔板）：   

1、 血清（浆）CAT活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mL）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA=918×ΔA

2、 组织CAT活力计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/mg prot）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=918×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/g mass）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷样本鲜重（g/mL）=918×ΔA÷样本鲜重（g/mL）

3、 细菌或细胞中CAT活力计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在每分钟反应体系中每分钟催化1nmol H₂O₂降解定义为一个酶活力单位。

CAT（U/10⁴ cell）＝反应总体积÷样本体积÷反应时间÷H₂O₂消光系数×ΔA÷细胞密度（10⁴ cell /mL）=1.836×ΔA

注意事项：

1、 预实验如果发现酶活性过高（其实OD值过大），可用提取液适当稀释样品。

2、 如果酶活性过低，延长反应时间（3分钟之内），并将反应时间准确代入计算公式。