酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书

可见分光光度法

产品简介：

PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：

提取液：液体，60ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体，40ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体，10ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体，20ml×1瓶，4℃保存

操作步骤：

一、 粗酶液提取：   

1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μl提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约0.2g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定操作表：

试剂名称（μl）	测定管	对照管
试剂一	600	600
试剂二	150	150
样本	150
煮沸的样本		150
37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入冰浴中冷却
试剂三	300	300

充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，用蒸馏水调零，525nm处检测测定管和对照管吸光度。

注意:每个测定管需要设置一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行1min沸水浴处理

PPO活性计算：

1、血清、血浆或果汁PPO活性计算

单位定义：每分钟每毫升样品在每毫升反应体系中使525nm吸光值变化0.01为一个酶活力单位

PPO（U/mL）=（A测定-A对照）×反应总体积÷(V液*×V样*÷V样总*) ÷0.01÷反应时间

=80×（A测定-A对照）÷V液*

2、组织中PPO活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每毫升反应体系中使525nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=反应总体积（1200μl）÷样本体积（150μl）÷反应时间（10min）÷0.01×（A测定-A对照）÷蛋白浓度（mg/ml）=80×（A测定-A对照）÷蛋白浓度（mg/ml）

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每分钟每g组织蛋白在每毫升反应体系中使525nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=反应总体积（1200μl）÷样本体积（150μl）÷反应时间（10min）÷0.01×（A测定-A对照）÷样本鲜重（g/ml）=80×（A测定-A对照）÷样本鲜重（g/ml）

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每毫升反应体系中使525nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。

PPO（U/10⁴ cell）=反应总体积（1200μl）÷样本体积（150μl）÷反应时间（10min）÷0.01×（A测定-A对照）÷细菌或细胞密度（10⁴/ml）=80×（A测定-A对照）÷500*

 

*V液：加入的血清、血浆或果汁的体积

*V样：加入样本体积

*V样总：加入提取液体积

*500：细菌或细胞总数500万