PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

 

产品名称：转基因元件NOS启动子PCR试剂盒50次

英文名称：PCR kit for NOS promoter of transgenic elements

产品规格：50次

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

运输：低温、避光，快递免费送货上门。
特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增与其他植物没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

使用方法:

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N 2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以下是公司正在热销的产品：

肝细胞培养基HM-prf3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(>99.0%(GC)(T))3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic Acid 质量规格：>99.0%(GC)(T)

REG4 Others Human 人 REG4 / RELP / GISP 人细胞裂解液 (阳性对照) 4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(>98.0%(HPLC)(T))4'-Hydroxyazobenzene-2-carboxylic Acid质量规格：>98.0%(HPLC)(T)

EB病毒转化的人B细胞;KM94012',3'-二脱氧尿苷(ddU)2',3'-Dideoxyuridine质量规格：>98%,进分

HNE2细胞，人鼻咽癌细胞 小鼠瘤细胞,Yac-1细胞 CM-H014人气管平滑肌细胞完全培养基100mL潮霉素BHygromycin B质量规格：>90%,粉末,进分

Neuro-2a/N2a(小鼠脑神经瘤细胞) 5×106cells/瓶×25'-O-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N2-异丁酰基-2'-脱氧鸟苷(DMT-ibu- dG)iBu-DMT-dG质量规格：>98%,BR

MDA-MB-231, 人癌细胞N-乙酰氨基葡萄糖（标准品）质量规格：>98%,标准品N-Acetyl-D-Glucosamine

人非小细胞肺腺癌细胞;NCI-H157 大鼠子宫成纤维细胞完全培养基 100mL托吡卡胺（标准品）质量规格：含量测定Tropicamide

H-4-II-E 大鼠肝细胞瘤细胞奥拉西坦（标准品）质量规格：供检查用Oxiracetam

CD28 Others Human 人 CD28 人细胞裂解液 (阳性对照) 盐酸贝凡洛尔（标准品）质量规格：含量测定Bevantolol hydrochloride

615小鼠前胃癌瘤株;Fc盐酸奥昔布宁（标准品）质量规格：含量测定Oxybutynin HCl

HL-60, 人早幼粒白血病细胞 单核细胞-巨噬细胞,RAW264.7细胞 Hep G2(人肝癌细胞)1,4-二(4-甲基-5本基-2-咪唑)本1克2～8℃，避光

小鼠神经母细胞瘤细胞;Neuro-2a [N2a; Neuro-2a]Perilloxin Perilloxin (HPLC,≥98%) 263249-77-0 5MG 通用试剂

HA Others Influenza B 乙型流感 (B/Florida/4/2006) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人细胞裂解液 (阳性对照)

转基因元件NOS启动子PCR试剂盒50次TNFSF10 Protein Human 重组人 TNFSF10 / AIL / APO-2L / CD253 蛋白布里杰35，英文名或英文缩写：Brij-35，级别：BR，70%，规格：100毫克

人上皮细胞(HMEpiC) (5×105) THP-1人单核白血病细胞 Human2-肖基本安(易制暴) 2-nitnocnilinq

人胚肾细胞;293 Cells, low passageα-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，英文名或英文缩写：α-Galactosidase preparation from green coffee beans，级别：标准品，7万u/mg，规格：5克

SEZ6L2 Others Human 人 SEZ6L2 / PSK-1 人细胞裂解液 (阳性对照) 龙胆酸，英文名或英文缩写：DHB，级别：高，98%，规格：100克

CL-0392NCI-H2087(人非小细胞肺腺癌细胞)5×106cells/瓶×2554-95-0均本三 95%Trimesic acid

PCR反应五要素： 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。