PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

 

产品名称：转基因元件tml3终止子PCR试剂盒50次

英文名称：PCR kit of tml3 Terminator

产品规格：50次

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

运输：低温、避光，快递免费送货上门。
特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增与其他植物没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

使用方法:

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N 2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以下是公司正在热销的产品：

HNE2-LMP1/2细胞，人鼻咽癌细胞系 小鼠肝癌细胞,H22细胞 CM-H071人肾动脉平滑肌细胞完全培养基100mL4-硝基儿茶酚4-NITROCATECHOL质量规格：>98.0% ，进口分装

OS-RC-2(人肾癌细胞) 5×106cells/瓶×2曲格列酮Troglitazone(CS-045)质量规格：>98%,BR

Promocell C-27101 Chondrocyte Growth Medium, 软骨细胞生长培养基(即用型) 500ml2-氨基-4'-氟二苯甲酮2-Amino-4'-fluorobenzophenone 质量规格：>98%

骨骼肌细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)2-氨基-4'-氯二苯甲酮2-amino-4'-chlorobenzophenone 质量规格：大于98%，化学

WIF1 Others Mouse 小鼠 WIF1 / WIF-1 人细胞裂解液 (阳性对照) 原百部碱(标准品)Protostemonine质量规格：HPLC≥98%，标准品

MMP8 Others Mouse 小鼠 MMP8 / CLG1 CHO细胞裂解液 (阳性对照) 尿嘧啶（标准品）质量规格：含量测定Uracil

EB病毒转化的人B细胞;KM9801溴丙胺肽林（标准品）质量规格：HPLC法含量测定Propantheline bromide

豹猫肺成纤维样细胞;LCL1 张氏肝细胞，HeLa[Chang Liver]细胞 LLC-PK1细胞，猪肾细胞盐酸妥洛特罗（标准品）质量规格：HPLC法含量测定Tulobuterol hydrochloride

人肺成纤维细胞;HFL1无水1酸氢二钠（标准品）质量规格：含量测定N-(Isoxazol-5-yl)sulphanilamide

HA Others H6N1 甲型流感 H6N1 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) 尿嘧啶 质量规格：>99%,可用于细胞培养Uracil

EB病毒转化的人B细胞;KMY0903依来蓝Rshēng huà shì jì容量：500KU

REG1A Others Rat 大鼠 REG1A / PSPS 人细胞裂解液 (阳性对照) 2-溴安溴化轻 2-Bromoqthylcminq xy7nobromidq 276-47-8

人卵巢微血管内皮细胞完全培养基 100mL一溴化铜，英文名或英文缩写：Cuprous bromide，级别：CP，98%，规格：25克

P3/NSI/1-Ag4-1[NS-1]细胞，小鼠骨髓瘤细胞 SRSV/3T3(SRSV

转基因元件tml3终止子PCR试剂盒50次MN-c, 小鼠皮质神经元DG-18琼脂25毫升2～8℃

小鼠神经干细胞BOC-D-天冬酸 Boc-Asp-OH,99% 13726-67-5 1G 通用试剂

人胚胎，皮肤，肌肉;M-22 人食管上皮细胞完全培养基 100mL布洛芬 Ibuprofqn 12687-7-1

人间充质干细胞(脂肪)cDNAHMSC-ad cDNAMFC培养基1米

TNFSF11 Others Human 人 RANKL / OPGL / TNFSF11 / CD254 人细胞裂解液 (阳性对照) 1400-62-0地衣红ORCEIN

PCR反应五要素： 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。