PCR实验步骤:
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
产品名称:转基因元件E9’终止子LAMP试剂盒50次
英文名称:Lamp kit of transgenic element E9 'Terminator
产品规格:50次
产品保存:-20℃保存
产品有效期:一年
储存条件:-20℃避光保存,避免反复冻融。
运输:低温、避光,快递免费送货上门。
特点:
1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物经过精心优化,专一性强,只扩增与其他植物没有交叉反应。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. PCR mix 中含上样染料,PCR 后可以直接上样电泳。
5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次,但只能用于科研。
使用方法:
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品,必须设置N 2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
以下是公司正在热销的产品:
人胃腺癌细胞;SGC-7901 [SGC7901]3'-Epi 吉西他滨3'-Epi Gemcitabine (Gemcitabine Impurity)质量规格:美国进口
仓鼠肾细胞;HL-1 骨髓瘤细胞,P3/NSI/1-Ag4-1[NS-1]细胞 3T3/Fas/com细胞,转基因细胞1'-Epi 盐酸吉西他滨1'-Epi Gemcitabine Hydrochloride质量规格:美国进口
人胚肾细胞;293 [HEK-293]4-羟基雌激素酮4-Hydroxy Estrone质量规格:美国进口
ACPL2 Others Human 人 ACPL2 人细胞裂解液 (阳性对照) 雌激素酮 β-D-葡萄糖苷酸钠盐Estrone β-D-Glucuronide Salt质量规格:美国进口
家猪皮肤细胞;SSC-S1?8,9-脱氢雌激素酮 3-硫酸钠盐?8,9-Dehydro Estrone 3-Sulfate Salt质量规格:美国进口
PILRB Others Mouse 小鼠 PILRB1 人细胞裂解液 (阳性对照) 4-氧依托度酸质量规格:美国进口4-Oxo Etodolac
小鼠子宫内膜上皮细胞完全培养基 100mLN-甲基依托度酸质量规格:美国进口N-Methyl Etodolac
H1650-M3人非小细胞肺癌细胞 H1650-M3 cells in human non small cell lung cancer 1640+10%FBS依维莫司-d4质量规格:美国进口Everolimus-d4
IL10 Protein Human 重组人 IL10 / Ierleukin-10 蛋白D 13223-d4 (氟吡汀代谢产物) 质量规格:美国进口D 13223-d4 (Flupirtine Metabolite)
SK-N-BE(2) (人神经母细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 U937(组织细胞瘤)依匹斯汀质量规格:美国进口Epinastine
NR8383(大鼠肺泡巨噬细胞) 5×106cells/瓶×2 人 PRAP1 / Proline-rich acidic 人细胞裂解液 (阳性对照) wo7iumcaonateanxy7nous碳酸钠50毫克AR,99%
KM3, 人多发性骨髓瘤细胞偶氮胂Ⅰ Arsenazo I,90% 3547-38-4 1G 通用试剂
SERPINB8 Others Mouse 小鼠 SerpinB8 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) GDX105 GDX-105
人胚肺二倍体细胞;HL芴甲氧羰基-L-缬酸,
转基因元件E9’终止子LAMP试剂盒50次大鼠食管上皮细胞完全培养基 100mL草酸氢钾shēng huà shì jì容量:250克
OVCAR-3人卵巢癌细胞 Human ovarian cancer cell line OVCAR-3 1640+10%FBS2,2,2-三录基录加醋酯 2,2,2-Trichloroqthyl xlonofonmctq 17341-93-4
EREG Protein Mouse 重组小鼠 Epiregulin / EREG 蛋白 (Fc 标签)钼粉shēng huà shì jì容量:250克
MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨细胞前体细胞) 5×106cells/瓶×2 婴儿真皮成纤维细胞Many types of cells包装:5 × 105方(1ml)SCCRAM肉汤shēng huà shì jì容量:RT250克
人脐动脉平滑肌细胞1993-7-23.4-二甲氧基本3,4-Dimetxoxybenzoic acid
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2
引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G C含量以40-60%为宜,G C太少扩增效果不佳,G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是zui末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。