PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

产品名称：转基因品系油菜HCN10染料法qPCR试剂盒50次

英文名称：QPCR kit for hcn10 dye method in transgenic rapeseed

产品规格：50次

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

运输：低温、避光，快递免费送货上门。
特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增与其他植物没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

使用方法:

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N 2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以下是公司正在热销的产品：

人骨骼肌卫星细胞cDNAHSkMSC cDNA苯甲酰乌头原碱（标准品）Benzoylhypacoitine质量规格：HPLC≥98%，标准品

IL12A Others Cynomolgus 食蟹猴 / 恒河猴 IL12A / NKSF1 人细胞裂解液 (阳性对照) 苯甲酰乌头原碱（标准品）Benzoylaconine质量规格：HPLC≥98%，标准品

tTA基因修饰的小鼠畸胎瘤细胞(B类);P19-CAG-tTA-3C8蝙蝠葛碱(标准品)Dauricine质量规格：HPLC≥98%，标准品

小鼠诱导性多潜能干细胞;PUMC-mips-A5 胰蛋白酶(含100mL 酶解缓冲液) 10mL表白桦脂酸(标准品)Epibetulinic acid质量规格：HPLC≥99%，标准品

细胞名称 种属表儿茶素(标准品)Epicatechin (EC)质量规格：HPLC≥98%，标准品

小鼠B细胞杂交瘤细胞;SH2美他环素,甲1土霉素(标准品)质量规格：分析标准品Metacycline HCl;Methacycline HCl

IL13RA2 Others Canine 狗 IL13RA2 / IL13R 人细胞裂解液 (阳性对照) 美他环素,甲1土霉素盐酸盐质量规格：potency>877U per mgMetacycline HCl;Methacycline HCl

CM-R122大鼠视网膜神经节细胞完全培养基100mL己二酸二质量规格：>98%Adipic dihydrazide

KYSE30细胞，人食管鳞癌 人胶质母细胞瘤细胞,A172细胞 山羊皮肤细胞;WGS1alpha-亚麻酸(标准品)质量规格：≥98.5%(GC),分析标准品Linolenic acid

CCRF-CEM(人急性白血病细胞) 5×106cells/瓶×2地蒽酚（标准品）质量规格：含量测定ANTHRALIN

NCI-295R细胞，人肾上腺皮质腺癌细胞 小鼠艾氏腹水瘤细胞TCM15,S180细胞 CL-0226SW626(人卵巢癌细胞)5×106cells/瓶×2DL-Isocitricacidtriwo7iumsaltDL-异柠檬酸钠100克BR，95%

WISH(人羊膜细胞) 5×106cells/瓶×22′-脱氧鸟苷 -15N2,99% 961-07-9 250MG 通用试剂

HCASMC-c 人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC) 500,000cells 小肠隐窝上皮细胞Many types of ce

转基因品系油菜HCN10染料法qPCR试剂盒50次CW-2 人结肠癌细胞没食子酸100毫克

HT-29人结肠癌细胞 HT-29 human colon cancer cells McCoy's 5a+10%FBS姆沙伯　108 CHROMOSORB(R) 108 8902/8/6

TNFSF12 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 / 人 TNFSF12 蛋白 (Fc 标签)1,4-双(5-苯基-2-恶... 1,4-Bis(5-phenyl-2-oxazolyl)benzene (... 1806-34-4 5G 通用试剂

人虹状体上皮细胞 (HIPEpiC)( 5×105 ) HUM, 正常人主动脉平滑肌细胞 Human氢氧化100克

人T瘤细胞Jurkat亚系;Jurkat77(+)Glucose

PCR反应五要素： 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。