PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

产品名称：转基因品系棉花GHB614染料法qPCR试剂盒50次

英文名称：Dye qPCR kit for transgenic cotton ghb614

产品规格：50次

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

运输：低温、避光，快递免费送货上门。
特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增与其他植物没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

使用方法:

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N 2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以下是公司正在热销的产品：

INSR Others Human 人 Insulin Receptor / INSR / CD220 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 表儿茶素没食子酸酯ECG 质量规格：HPLC≥98%，BR

CM-H126人小脑颗粒细胞完全培养基100mL莱苞迪甙ARebaudioside A质量规格：>98%,BR

HT-29, 人结肠癌细胞 貂肺上皮细胞,Mv1Lu细胞 SW620 [SW-620](人结肠腺癌细胞)莱苞迪甙A（标准品）Rebaudioside A质量规格：HPLC≥98%，标准品

小鼠子细胞;U14环亮氨酸甲酯盐酸盐Cycloleucine Methyl Ester.HCl质量规格：>98%

IL7R Others Human 人 IL7Rα / CD127 人细胞裂解液 (阳性对照) 水溶性四氮唑-3GLT003质量规格：BR

小鼠巨噬细胞MMaUDPGA Na；尿苷-5'-二1酸葡糖醛酸三钠盐质量规格：≥98%；美国进口Uridine 5'-diphosphoglucuronic acid tri salt

22RV1细胞，人前列腺癌细胞 猪肾细胞,LLC-PK1细胞 人肾皮质上皮细胞HRCEpiC替卡西林,替卡西林二钠质量规格：BR,二钠盐Ticarcillin di salt

HPAC(人胰腺腺泡上皮癌) 5×106cells/瓶×2胡椒碱(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Piperine

293T(人胚肾细胞) 5×106cells/瓶×2 CM-H051人胎盘滋养层细胞完全培养基100mL 人膀胱基质成纤维细胞RNAHBdSF miRNA5 μg纽莫康定B0(肺囊康定) 质量规格：>95%Pneumocandin B0

CM-R087大鼠软骨细胞完全培养基100mL福莫特罗 质量规格：>98%Formoterol

MSTO-211H(人肺癌细胞) 5×106cells/瓶×2β-蛋白组学级100MLRT

Promocell C-24010 MelanocyteGrowthMedium , 色素细胞生长培养基(即用型) 500ml拂化轻铵;醋性拂化铵 cMMoniuM bifluoridq

骨骼肌细胞培养基SkMCM-prf邻本二加醋二丁酯 dibutyl phthclctq 84-74-

HA Others H1N1 甲型流感 H1N1 (A/USSR/90/1977) 血凝素 (Hemagglutinin /

转基因品系棉花GHB614染料法qPCR试剂盒50次CCC-HEL-1细胞，人胚肝二倍体细胞 小鼠腹水瘤细胞,SAC-II B2细胞 EB病毒转化的绒猴细胞;B95-8大黄酸质量规格：HPLC≥98%，BRRhein

MLTC-1(小鼠间质细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2大黄酸(标准品)质量规格：HPLC≥98%,标准品Rhein

Promocell C-23110 Fibroblast Growth Medium KIT,成纤维细胞生长培养基套装 500ml大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Rhein-8-O-β-D-glucopyranoside

细胞大蓟苷质量规格：HPLC≥98%，标准品Pectolinarin

TSLP Others Mouse 小鼠 TSLP 人细胞裂解液 (阳性对照) 大观霉素（标准品）质量规格：效价测定spectinomycin

PCR反应五要素： 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。