PCR实验步骤：

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

产品名称：转基因品系棉花MON88913染料法qPCR试剂盒50次

英文名称：Dye qPCR kit for transgenic cotton mon88913

产品规格：50次

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融。

运输：低温、避光，快递免费送货上门。
特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增与其他植物没有交叉反应。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

使用方法:

一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N 2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以下是公司正在热销的产品：

PDGFRB Others Human 人 CD140b / PDGFRB 人细胞裂解液 (阳性对照) 布比卡因碱,丁吡卡因Bupivacaine base质量规格：>98%

人急性单核细胞白血病细胞;THP-1布比卡因(标准品)Bupivacaine base质量规格：HPLC>98%,标准品

PDGFRA Others Human 人 PDGFRa / CD140a 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 马来酸桂哌齐特Cinepazide maleate质量规格：>99%

CL-0453TE-10(人食管癌细胞)5×106cells/瓶×2马来酸桂哌齐特(标准品)Cinepazide maleate质量规格：含量测定

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) NRRL 2543[LSHTM BB325]细胞 HFL-I(MEMα)(胚肺成纤维细胞)磺胺嘧啶钠 sulfadiazine(SD-Na)质量规格：>98%,BR

小鼠胚胎成纤维细胞;BALB/C 3T3黄芪皂苷II(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Astragaloside II

MAPK14 Others Human 人 p38 alpha / MAPK14 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 黄芪皂苷III(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Astragaloside III

B16-F10, 小鼠色素瘤高转移细胞黄芪总皂苷（标准品）质量规格：UV≥98%，标准品Astragaloside

MEF, 小鼠胚胎成纤维细胞 人胰腺癌细胞，NCL-H548细胞 MDCK (NBL-2)(狗肾细胞)黄杞苷（标准品）质量规格：HPLC≥98%，标准品Engeletin

人恶性色素瘤细胞;A-375 [A375]黄芪多糖(68%)质量规格：>68%2-(Chloromethyl)-4-(4-Nitrophenyl)-1,3-thiazole

CL-0027AsPC-1(人胰腺癌细胞)5×106cells/瓶×2测试盒(化学法测NO2)25块/盒RT

小鼠红白血病细胞;MEL 小鼠气管平滑肌细胞完全培养基 100mL苯唑西林钠 Oxacillin  salt,95% 1173-88-2 5G 通用试剂

大鼠主动脉平滑肌细胞 Rattus轻典醋;典轻醋 xy7noiodic ccid 10034-82-

SDC1 Others Mouse 小鼠 SDC1 / Syndecan-1 / SYND1 / CD138 人细胞裂解液 (阳性对照) AMM

转基因品系棉花MON88913染料法qPCR试剂盒50次mRTEC, 小鼠肾小管上皮细胞L-赖酸-L-谷酸，英文名或英文缩写：L-Lysine L-glutamate salt，级别：BR，98%，规格：5克

人口腔表皮样癌细胞;KB 大鼠尿道上皮细胞完全培养基 100mL苄基异青醋97% BqNZYL ISOTHIOCYcNcTq 6-78-6

PC-12(低分化) 大鼠肾上腺嗜鉻细胞瘤细胞(低分化)DEAE-葡聚糖凝胶 A-25 DEAE Sephadex A-25 12609-80-2 100G 分离试剂

DLL1 Others Mouse 小鼠 DLL1 / Delta-1 人细胞裂解液 (阳性对照) 藻红，英文名或英文缩写：Pyrosine B，级别：ACS，规格：500克

人恶性非霍奇金瘤患者的自然杀伤细胞;NK-92MI [NK92MI]MacConkeyAgar 250g/1kg/5kg 国产

PCR反应五要素： 

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列zui有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。