细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。

    一、温度

   一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在40℃数小时后，再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。

   高温对细胞培养不利。细胞在39～40℃培养1小时，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41～42℃中培养1小时，细胞损伤严重，温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。

   二、气体环境和pH

   体外培养细胞需要理想的气体环境，氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件之一。氧参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态，若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。采用开放式培养时(碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养)，一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。

   CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长；一般不能低于1%，否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH7.2~ pH 7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至退变或死亡。各种细胞对pH的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差，永生性细胞系和恶性细胞对pH的变动耐力强。但总的来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，使培养基变酸，pH发生变化。所以，为了维持培养环境恒定的pH，多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2，但CO2易于逸出，故只适用于封闭式培养。若开放式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜。为克服NaHCO3调整的麻烦，也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethyl piperazine-N＇-ethanesulfonic acid, Hepes)，它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。

    三、渗透压

   细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影响细胞基本合成系统。

   理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L，鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。

   四、辐射线和超声波

    (一)可见光

   可见光的波长是3900~7800?。可见光的各种有色光能引起细胞退变，延长核分裂的间期，还可显著降低细胞的附壁能力。因此，体外培养细胞应避免日光直接照射，最好在黑暗中进行培养或短期存放。

    (二)紫外线

   弱紫外线下耐受能力强的细胞变化不大，但对敏感的细胞有损害。紫外线强时，新分离的细胞显示：不能进行完全的有丝分裂；在有丝分裂时增加了脱水收缩；在有丝分裂时细胞质的起泡减少。Elrlich腹水癌细胞经紫外线照射后，用飞点紫外线显微镜观察发现被照射表面形成水泡，随后细胞膨胀，损害也渐变严重。

 

 筛选稳定细胞株的两种方法
       1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系
       对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
       另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
       2、病毒感染筛选稳定细胞株
       病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
       稳定转染细胞株服务流程
      1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。
      2、筛选浓度测定：以 10-14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。
      3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到 60%-80% 覆盖。
      4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。
      5、抗生素筛选。
      6、鉴定筛选结果。
     最终交付
     1、病毒滴度检测报告；稳转细胞株；
     2、结题报告，包括详细的实验流程，测序结果和峰图、引物序列、载体图谱和滴度测定报告和q-P