抗体纯化磁珠

1.抗体纯化磁珠试剂盒是否可以重复使用？
答：不推荐重复使用，不同样本之间容易造成污染。

2.若体系中含有木瓜蛋白酶，是否影响磁珠的使用？
答：木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，目前对protein A的影响未知，建议客户慎用。

3.1mL抗体纯化磁珠能够用多少次?
答：1mL磁珠能够结合1.5-2.0mg抗体，客户需要根据结合抗体的量来确定使用磁珠的量。

4.试剂盒中的缓冲液用完后，能否告知配方？
答：试剂盒中缓冲液的成分都是保密的。可以采用以下的缓冲液进行替代。
结合缓冲液:PBST
150mM PBS，150mM NaCl，0.1% (v/v) Tween-20，pH7.2

洗脱缓冲液:甘氨酸缓冲液
0.1M Glycine，0.1% (v/v) Tween-20，pH2.5（该缓冲液适合于耐酸性的抗体）。
0.1M Glycine，3M MgCl2 (4M protein A/G) ，0.1% (v/v) Tween-20，pH4.5（该溶液含较高浓度的盐，不可直接进行SDS-PAGE。可以用透析或超滤的方法去除过多的盐）。

保存缓冲液：
50mM Tris-HCl，0.1%(v/v) Tween-20，0.01%(w/v) NaN3，pH7.5

洗涤缓冲液：
50mM Tris-HCl，0.1%(v/v) Tween-20，pH7.5）

再生缓冲液：
1% (v/v) TritonX-100

His-tag蛋白纯化篇
1.蛋白不吸附或亲和力低
首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。
（1）有目标蛋白，但大量穿透：
a、蛋白不含有标签或未能正确表达
解决措施：Western Blot鉴定目标蛋白是否有His-Tag。若没有，需要重新构建载体，添加组氨酸标签，并确认标签正确表达。
b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露
解决措施：
在不变性条件下纯化蛋白，在样品和平衡缓冲缓冲液中加1-2M尿素，这样蛋白结构相对松散，而蛋白不会变性。
在变性条件下纯化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M盐酸胍使蛋白变性。如果蛋白有二硫键，最好加1-2mM DTT或1~5mM巯基乙醇（在样品中添加），可以改善蛋白的吸附。
重新构建载体，将组氨酸标签换到另外一端，或在组氨酸标签基因与目的基因之间增加一段Linker，可以降低蛋白折叠后标签被掩盖的几率。
c、标签太短  
解决措施：将标签的组氨酸数量增加至6-10个。
d、蛋白标签被水解
解决措施：添加合适的蛋白酶抑制剂；尽量在低温下处理样品；对于分泌表达的蛋白，长时间存放将增加蛋白被降解的风险，应尽快处理样品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集
解决措施：在结合缓冲液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100，或5%~50%的甘油，可以增加蛋白的溶解度，减少蛋白聚集。
f、样品及结合缓冲液不合适
解决措施：确认样品及缓冲液中不含有EDTA、还原剂等。另外，将样品及结合缓冲液pH调节至7.4~8.5，有利于蛋白结合。
（2）有目标蛋白，但含量很低：
蛋白表达量低。解决措施：对样品进行浓缩，增加磁珠用量、延长反应时间；优化表达条件（诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间，培养基等）；或更换其他合适的表达载体或表达系统。

2.纯化得到的蛋白量少
（1）磁珠用量不足。本产品磁珠悬液浓度为10%，对于亲和力较高的蛋白，每毫升磁珠悬液可结合的蛋白量约为3~4mg。用户需要根据目标蛋白含量，使用足够量的磁珠。对于亲和力较低的蛋白，需要增加磁珠用量，延长反应时间，或提高样品及结合缓冲液pH。
（2）蛋白与磁珠亲和力较低。参考问题1。
（3）蛋白浓度低。对样品进行浓缩，或增加磁珠用量、延长反应时间。
（4）磁珠重复使用次数太多。将磁珠进行再生处理（参考产品说明书）。

3.洗脱产物杂带多什么原因？怎么处理？
（1）杂蛋白吸附。由于组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等是蛋白质中很常见基团，而蛋白折叠可能导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和磁珠的作用力增加。可以用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，在样品及平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton X-100，或5~50%的甘油，可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，或使用钴离子螯合磁珠（BeaverbeadsTM IDA-Cobalt）。此外，要获得纯度较高的蛋白，需要对裂解、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液的组分、pH、咪唑浓度等进行优化。若还是不能获得高纯度的蛋白，则需要考虑使用多步纯化，结合使用离子交换、凝聚过滤等纯化方法。
（2）菌体破碎条件太剧烈导致蛋白断裂。确保在冰浴条件下破碎；降低超声破碎的强度，缩短时间；适当稀释样品，添加核酸酶，降低样品粘稠度。
（3）蛋白被部分水解。添加合适的蛋白酶抑制剂，并尽可能在低温下操作。

4.目标蛋白难洗脱
穿透组分中目标蛋白明显减少，而洗脱组分中目标蛋白很少，取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加热5~10min，离心跑电泳，如果发现较多蛋白残留。
（1）洗脱调节太温和。提高洗脱液咪唑浓度至700mM还不能洗脱时，可以尝试降低洗脱液pH至4.0，但低pH会也导致金属离子脱落，磁珠需要再生后再使用。
（2）蛋白吸附在磁珠上无法洗脱。对于非特异性疏水吸附的蛋白，可以增加NaCl浓度至1M，或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脱。对于聚集沉淀在磁珠上的蛋白（尤其注意含有二硫键的蛋白），可以在洗脱缓冲液中加入6M盐酸胍进行变性洗脱。

5.磁珠再生后，蛋白纯化效果变差怎样改善?
（1）再生过程的碱处理可以改善再生磁珠的蛋白纯化效果，参考海狸生物医学《组氨酸标签蛋白纯化试剂盒》说明书中磁珠再生部分步骤4。
（2）重新挂金属离子后为清洗干净，需要增加洗涤步骤。残留的金属离子优先跟蛋白结合，影响蛋白与磁珠的结合。

6.缓冲液中咪唑添加的意义
（1）结合缓冲液中低浓度的咪唑是为了减少杂蛋白的非特异性吸附；
（2）洗涤缓冲液中低浓度咪唑是为了吸取吸附能力较弱的杂蛋白；
（3）洗脱液中高浓度咪唑是为了洗脱目的蛋白。

7.IDA-镍和IDA-钴的区别
IDA-镍的蛋白载量高，40mg/mLgel，纯度稍低，纯度有90%。
IDA-钴的蛋白载量稍低,25mg/mLgel,纯度达到95%。
一般客户建议购买IDA-镍磁珠，即可达到目的。