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ELISA实验标本的采集、处理和保存
R&D elisa试剂盒样本处理及要求
1. 血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2. 血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
R&D elisa试剂盒需要而未提供的试剂和器材
1. 酶标仪(450nm)
2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
4. 蒸馏水或去离子水
elisa试剂盒试剂盒组成
名称 |
96孔配置 |
48孔配置 |
备注 |
微孔酶标板 |
12孔×8条 |
12孔×4条 |
无 |
标准品 |
0.3mL*6管 |
0.3mL*6管 |
无 |
样本稀释液 |
6mL |
3mL |
无 |
检测抗体-HRP |
10mL |
5mL |
无 |
20×洗涤缓冲液 |
25mL |
15mL |
按说明书进行稀释 |
底物A |
6mL |
3mL |
无 |
底物B |
6mL |
3mL |
无 |
终止液 |
6mL |
3mL |
无 |
封板膜 |
2张 |
2张 |
无 |
说明书 |
1份 |
1份 |
无 |
自封袋 |
1个 |
1个 |
无 |
备注:
经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。
R&D elisa试剂盒注意事项
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9. 不能使用过期产品。
10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
R&D elisa试剂盒试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
R&D elisa试剂盒操作步骤
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。
能够应用ELISA 实验的样本种类很多,有血清,血浆,细胞上清,细胞裂解液,尿液,关节滑液,脑脊液,肺泡灌洗液,各种组织的组织匀浆;采集和处理的方式都不相同。下面就列出了biotnt 收集的给类样本的采集、处理和保存方式。方法大多出自文献和试剂盒说明书,部分方法经Biotnt 验证过,但有的方法并没有实际操作过,所以,以下方法仅供参考。
一、ELISA实验中血清的采集、处理和保存;
1、 真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;
2、 采血后室温静置1小时;
3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
4、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的 ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。
二、ELISA实验中血浆的采集、处理和保存;
1、 真空采血针采集2ml新鲜血液,加入无菌试管中;
2、 按1:9加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠),30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染;(也可以直接用抗凝管采集);
3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心5min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
4、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。 请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。
注意事项:制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。
三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存;
1、 采集尿液样本500ul,加入无菌试管中;
2、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀。
3、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
4、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存;
1、采集脑脊液样本,加入无菌试管中;
2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的样本留上清,弃下面沉淀。
3、取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存;
1、采集细胞培养上清液500ul,加入无菌试管中;
2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
3、取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)
1、 取细胞培养板或细胞悬液,用PBS(PH7.2-7.4)洗涤细胞培养板1-2次。
2、 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂(裂解液),使细胞破坏并放出细胞内成份。
3、 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心20min,,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
4、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
5、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
七、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存;
1、 10%水合氯醛溶液,腹腔麻醉。
2、 打开腹腔,另取10ml注射器行下腔静脉采血,尽可能将血放尽。
3、 在冰面上对左肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5ml,分三次灌洗:2ml、1.5ml、1.5ml灌洗。回收率在70%以上。
4、 将肺泡灌洗液用离心机4℃,1500rpm离心10min。
5、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
6、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
八、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存;
1、 口腔关节:患者取坐位,常规消毒后,作皮下及关节后区局部浸润麻醉。然后嘱患者大张口,采用装有2ml生理盐水的注射器(5号针头)作关节上腔 穿刺,髁后进针,针尖方向斜向前、内、上,抵达关节结节后斜面后稍后退,回抽如发现有淡黄色液体,即表明已进入关节上腔,注入2ml生理盐水,反复注入、 回抽五次。
膝骨关节滑液:无菌穿刺取得关节液。
2、 将关节液用离心机4℃,1500rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
3、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
4、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
九、 ELISA实验中各类组织匀浆(容易匀浆的组织)的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)
1、 采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。
2、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织 的小烧杯放入冰水中)。
3、 匀浆的方式有多种:
a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。
b) 机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
4、 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
5、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
6、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。
十、ELISA实验中各类组织匀浆(不易匀浆的组织)的采集、处理和保存;(需要测蛋白浓度)
7、 采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。
8、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织 的小烧杯放入冰水中)。
9、 匀浆的方式有多种:
a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。
b) 机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
c) 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。
10、 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
11、 取上清。 分装冻存备用,
2-8℃下,可放置保存24-48小时;
-20℃下,可放置保存1个月;
-70℃下,可放置保存6个月;
12、 根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。